pglo transformation

PGLO-TRANSFORMATION

Formål

I dette forsøg lærer man at lave ændringer i en organisme ved hjælp af gener. Man vil lærer hvordan man ved hjælp af et plasmid flytter gener fra den ene organisme til den andet. Og man lærer at bestemme i hvilken grad organismen er ændret.

Teori
I transformationsforsøget bliver der gjort brug af pGLO-transformation, hvilket er en genetisk transformation, ved navn ”gensplejsning”. Hovedsageligt skyldes dette den trinvise overførsel af information fra DNA via mRNA til protein, som er molekylærbiologiens centrale dogme. Processen blev først beskrevet af Francis Crick, hvori den såkaldte ”transskription”, er den proces som tillader at aminosyrer bliver omdannet til proteiner. Selve udtrykket ”gensplejsning”, beskriver i princippet blot den handling, hvori ét gen fra en organisme, bliver indsat i en anden organisme. Hensigten bag gensplejsningen, er som regel, at man forsøger at videregive et sæt karaktertræk fra en organisme til et andet. Måden hvorpå selve processen foregår, indblander i første omgang at det eller de ønskede gener isoleres i den afgivende organisme, hvorefter transporteringen til den modtagende organisme gøres vha. plasmid, ligesom i forsøget. For at organismen skal modtage genet, bliver det udsat for én meget pludselig varme eller kulde, hvilket tillader at DNA-molekyler med nøjagtighed kan beskæres. En proces ved navn ”ligase” tillader til sidst at DNA-enderne kan sammensættes (på trods af at vi ikke gjorde disse ting i forsøget).

I dette forsøg blev der gjort brug af plasmidet pGLO. pGLO plasmidet består af araC, GFP, bla og ori. De to man kan kigget nærmere på i dette forsøg er araC og GFP. AraC er en regulator som bliver aktiveres når der er et sukkerstof kaldet arabinose til stede, hvilket så medvirker til at GPF-genet bliver aktiveret. GPF står for dannelse af grønt fluorescerende protein. Dog er der også blevet arbejdet med bla som er det gen der gør plasmidet resistent overfor antibiotikaet ampicilin, og ori som medvirker til at plasmidet kan dublere sig selv i bakterien E Coli som der er blevet arbejdet med.

Materialer
Kemikalier og lign.
Agar-plader, heriblandt 1 LB, 2 LB/amp og 1 LB/amp/ara LB-medium, som er vækstmedium Transformationsopløsning pGLO-plasmid

Apparatur og materialer:
1 LB-plade med bakteriekolonier Farvede mikrocentrifugerør 1 pakke sterile podenåle 5 pipetter 1 flamingoflyder Vandbad 42 oC 1 bakke med is Tusch Tape, helst smal malertape Varmeskab på 37 oC Sikkerhedsudstyr, som kittel og beskyttelsesbriller

Metode
1. Det første man gør, er at markere to mikrocentrifugerør med ”+DNA” og ”–DNA”, samt gruppens navn. Stil de lukkede rør i flamingoholderen.

2. Åbn rørene og overfør 250µL Transformation Solution (CaCl2) til hvert rør. CaCl2 bruges, da Ca-ionernes har en positiv ladning, som neutraliserer DNA’ets negative ladning.

3. Rørene placeres i is-badet. Det er lettere at arbejde sterilt, hvis væsken er kold når bakterierne tilføres.

4. Efter to minutter overføres bakteriekolonierne til eppendorfrør. Man opsamler en enkel bakterikoloni med en steril podenål, der placeres i eppendorfrøret og røres rundt ved at sno den mellem fingrene. Dette gøres med begge rør og stilles herefter tilbage i flamingoholderen.

5. Man tjekker så om plasmid-opløsningen lyser op under UV-lampen. Det skulle det helst ikke endnu. Så tager man en ny steril podenål og tager en ”loop-fuld” plasmid-opløsning, som tilsættes eppendorfrøret som er markeret med ”+DNA”. Husk at røre godt rundt.

6. Rørene skal så ligge i is-bad i 10 min, så indholdet klargøres til at tilsættes agar-pladerne. Det er vigtigt at sørger for rørene er helt nede i isen.

7. Mens rørene får de 10 min i is-bad, så klargøres agar-pladerne. De fire plader skal markeres således: 1 LB/amp plade mærkes ”+ DNA”. 1 LB/amp/ara plade mærkes ”+DNA”. 1 LB/amp plade mærkes ”-DNA”. 1 LB-plade mærkes ”-DNA”.

8. For at få membranerne til at åbne, så udsættes cellerne for et varmechok. Dette gøres ved at sætte dem ned i et 42 grader varmebad i nøjagtig 50 s. Det er vigtig at sørger for at rørene er helt nede i badet. Derefter skal de stilles i is-badet igen i præcis 2 minutter.

9. For at hjælpe cellevæksten i gang, så tilsættes der et næringsmedium. Dettes gøres ved at tage rørene op af is-badet, og lade dem stå ved stuetemperatur. Herefter tilsættes 250 µL LB-medium til begge rør som er markeret +DNA og -DNA. Herefter lades rørene stå i 10 min. Ved stuetemperatur. 10. Overførsel af bakterier til agar-pladerne. Dette gøres ved at knips på de lukkede rør, så det blandes godt sammen. Der bruges en ny steril pipette til hvert rør og så overføres der 100µL af bakterierne til de tilhørende plader. 11. Bakterier på hver plade spredes let med en steril podenål

12. Pladerne stables ovenpå hinanden, og kan eventuelt samles med tape. De stilles i et varmeskab på 37 grader, da bakterier vokser bedst ved denne temperatur. De inkuberes i et til to døgn.

13. Til sidst skal pladerne studeres i almindeligt lys og i UV-lys.

Resultater

1. LB/amp (+DNA)

På figur 1 kan man se den første agarplade. Den består af LB, amp og DNA. Man kan se en masse små bakterie kolonier der er blevet dannet.

Figur 1: Agar-plade 1 - LB/amp (+DNA)

2. LB/amp/arabinose (+DNA)

På figur 2 kan man se den anden agarplade. Den består af LB, amp, arabinose og DNA. Ved denne blanding kan man se at kolonierne er noget større end ved den første.

Figur 2: Agar-plade 2 - LB/amp/arabiose

3. LB/amp (-DNA)

På figur 3 kan man se den tredje agarplade. Den består af LB og amp. Ved denne blanding kan man ikke se nogen reaktion.

Figur 3: Agar-plade 3 - LB/amp (-DNA)

4. LB (-DNA)

På figure 4 kan man se den fjerde agarplade. Den består af LB. Ved denne blanding er det bakterie vækst på hele pladen, men ingen synlige kolonier.

-

Figur 4: Agar-plade - LB (-DNA)

Agaer-pladerne under Uv-stråling På figur 5 ses alle fire agar-plader under UV-lys. Som man kan se på billedet, så er der kun en af pladerne der lyser op, dette er agar-plade nr. 2.

Figur 5: Agar-plader under Uv-stråling

Figur 6: Agar-plade 2 under Uv-stråling

Diskussion
Forsøget gik som forventet: Agar-plade 1 dannede små kolonier af bakterier, men lyste ikke grønt i UV-lys. Agar-plade 2 dannede også kolonier, som lyste op i UV-lys, da arabinosen aktiverer gener.

Agar-plade nr. 1 og 2 indeholdte begge pGLO-plasmidet, men kun plade nr. 2 lyste op. Grunden til det er at pGLO-plasmidet indeholder GFP og araC. AraC aktiveres når der, som i plade 2, er arabinose til stede. Og da araC er et regulator-gen for GFP, som er et grønt fluorescerende protein, så bliver hele den grønne effekt aktiveret. Og plade nr. 1 ikke indeholder arabinose, så bliver den grønne effekt ikke aktiveret.

-

Agar-plade 3 dannede ingen kolonier, og viste heller ingen tegn på vækst. Det forventes der heller ikke, da der var antibiotika i agar-pladen, som hæmmer væksten af bakterier. Den lyste desuden heller ikke op under UV-lys.

-

Agar-plade 4 dannede vækst af bakterier over det hele i agar-pladen, men lyste ikke op under UV-lys.

Der var hverken pGLO-plasmidet eller arabinose i plade nr. 3 og 4, derfor kunne de ikke lyse op under UV-lys.

Ud fra resultaterne kan man konkludere at forsøget var vellykket og der ingen fejlkilder var. Dog kunne mulige fejlkilder være: 1

Forkerte mængder af de forskellige stoffer Blanding af forkerte stoffer Temperatur på varmeskabet, varme-badet og is-badet var for høj eller for lav.

I bekendtgørelsen om genteknologi og arbejdsmiljø er det et krav, at alt materiale der har været i

kontakt med genteknologi skal autoklaveres. Det sker i en autoklaver, som er et aparat der vha. en bestemt temperatur og et bestemt tryk steriliserer matrialet. Alt efter hvilken type materiale det er og hvilken størrelse det har kan man ændre på trykket og temperaturen i autoklaveren. Alt materialet skal autoklaveres, da levende bakterier der indeholder genteknologisk fremstillede plasmider ikke må
1

https://www.retsinformation.dk/Forms/R0710.aspx?id=121099

slippes ud i naturen. Samt kan den bakterie som der blev arbejdet med i dette forsøg lede til diarre, hvilket kan påvirke den næste bruger af matrialet hvis det ikke bliver autoklaveret.

Konklusion
Efter dette forsøg kan man konkludere, at der skal være arabinose til stede før genet GFP kan blive aktiveret. Da det var den eneste på agar-plade nr. 1 og 2, hvoraf kun nr. 2 lyste op under UV-lys. Udover det kan man også konkludere at der i plasmidet er et resistensgen overfor antibiotika ampicillin, fordi der stadig var en vækst af bakterier på agar-pladerne nr. 1 og 2, selvom der også var tilsat ampicillin. Det kan man se da ampicillinen havde en ganske fin effekt i agar-plade nr. 3, hvor der ikke var tilsat noget plasmid. Og ved at kreere det grønt fluorescerende stof vha. E Coli, så kan man konkludere at det er lykkedes at ændre en organismes genetik.