La membrana del endosoma se yema hacia adentro para formar una vesícula, una vesícula intraluminal, que eventualmente se acumula para formar lo que a veces se llama un endosoma multivesicular (MVE) o un cuerpo multivesicular (MVB). Ahora, durante décadas, se entendía que estos cuerpos multivesiculares entregan su contenido mediante fusión al lisosoma, donde las proteínas de la membrana y cualquier molécula que se internalice pueden degradarse en su ciclo de degradación.
Pero hace unos 20 años, se reconoció que a veces estos cuerpos multivesiculares se dirigen y se fusionan con la membrana plasmática, donde las vesículas intraluminales se expulsan al exterior de la célula y luego son absorbidas por macrófagos o por otras células o son dirgidos para la entrega de información.

Ahora bien, el problema con gran parte de los trabajos que se publican en este campo, a menudo en las llamadas "revistas de alto perfil" es que el material que las personas usan y con el que hacen afirmaciones sobre la función, se producen mediante un procedimiento de preparación muy crudo, por lo que, por ejemplo, células humanas en un cultivo pueden ser recolectadas (separar las células del medio condicionado, lo que se puede hacer con centrifugación) y con mucha frecuencia la gente toma el medio condicionado (medio con las condiciones necesarias para que ciertas líneas celulares puedan vivir)  y simplemente lo centrifuga a alta velocidad, recolecta la fraccion de sedimento y luego investiga el rol o las propiedades del material en esta fracción creyendo que el material puede ser simplemente vesículas extracelulares puras, sin embargo, me parece muy poco probable, habiendo sido entrenado como bioquímico, que este material sea puro.

Así que comenzando hace unos ocho años, con el interés de un estudiante graduado con el nombre de Matt Shurtleff, comenzamos a explorar las condiciones que podrían requerirse para purificar formas específicas de vesículas extracelulares y luego usar material purificado para investigar el contenido, centrándonos específicamente en pequeñas moléculas de ARN, que se empaquetan probablemente durante el proceso de invaginación, ya sea en un endosoma multivesicular o posiblemente mediante la captura desde el citoplasma en una vesícula que yema de la superficie celular.

Nos hemos centrado en esas moléculas de ARN, cómo son adquiridas por estas vesículas. Y, en última instancia, queremos explorar cómo estas vesículas pueden entregar ARN a una célula objetivo. Por el momento, permítanme emitir esta pregunta de que gran parte del trabajo que explica el rol de estas vesículas extracelulares en el targeting a través de otros tejidos se basa en material impuro que puede contener otras cosas más allá de las vesículas. Así que permítanme aclarar esto al ilustrar lo que Matt Shurtleff hizo en mi laboratorio hace varios años, decidimos purificar una forma particular de vesículas extracelulares producidas por células, una línea celular de riñón embrionario humano, células HEK293. En este caso, tomamos el medio condicionado, aclarado por sedimentación a baja velocidad y luego aislado por sedimentación a alta velocidad, una fracción de vesiculas o particulas. Luego suspendimos este material particulado en una alta concentración de sacarosa superpuesta con dos niveles más bajos de sacarosa, seguido de ultracentrifugación durante la noche donde las membranas flotantes flotan a una posición diferente dentro de este gradiente escalonado (gradiente en el que se cambia la composicion muy abruptamente, a diferencia del linear que tendría concentraciones continuas de sacarosa), mientras que otro material particulado, bastante abundante en el medio extracelular, sedimenta al fondo de la capa de sacarosa al 60%.

En este caso, seguimos una proteína marcadora particular, una proteína de membrana de la familia de las tetraspaninas  llamada CD63 que encontramos equilibrada entre las capas de 20 y 40% de sacarosa, mientras que otras membranas sedimentan en otras posiciones dentro de este gradiente. Decidimos que era poco probable que este material fuera completamente puro, por lo que tomamos esta fracción interfásica y la mezclamos con anticuerpos-inmovilizados anti CD63 (los anticuerpos tienen una alta afinidad por lo que es más fácil encontrar la CD63) y luego podemos continuar aislando una fracción más selecta de vesículas que contienen CD63. Y ahora estoy enfocado en nuestro análisis de los microRNA maduros que se encuentran en esta fracción de vesículas inmunoaisladas. Se encontró que al evaluar los aproximadamente 600 microRNAs diferentes que se expresan en las células HEK293, la mayoría de ellos, el 90% de ellos están en células o en exosomas en igual abundancia.

Alrededor del 10% de los microRNAs estaban enriquecidos en las vesículas inmunoaisladas. Pero incluso entre ellos, solo un subconjunto muy pequeño, cuatro o cinco, estaban muy enriquecidos, cientos de veces enriquecido, uno en particular llamado mir223 es, estimamos, alrededor de mil veces enriquecido. Eso dice mucho, dice que la célula se ha esforzado considerablemente para tratar de definir los ARN específicos para la captura y secreción por parte de la célula. Ahora, y al observar el pequeño conjunto de microARNs que están altamente enriquecidos, no encontramos ninguna similitud de secuencia primaria entre estos ARN, lo que sugiere que tal vez la célula estaba reconociendo diferentes secuencias de ARN.  Así que, sin embargo, con este microARN, mir223, pudimos investigar cómo se incorpora de forma selectiva en las vesículas. Y les contaré sobre nuestro enfoque en las siguientes diapositivas.

La pregunta es ¿qué hace este micro ARN? ¿La célula está administrando ese miRNA para targeting a otro tejido para algún propósito o la célula simplemente está desesperada por deshacerse de ese microRNA y por lo tanto lo enriquece y se deshace de él empaquetándolo en una vesícula? El hecho de que este enriquecido mil veces más que los otros miRNAs simplemente dice que la célula tiene una maquinaria que se dedica a la selección de ese microRNA y no a la de los otros. Entonces permítame continuar contándole acerca de nuestro enfoque para este problema que Matt ideó, ahora el primer experimento simple que Matt pudo hacer fue mostrar que este miRNA mir223 y otro microRNA mir244 altamente enriquecidos están empaquetados dentro de la vesícula

Claramente son internos a la vesícula y la forma en que demostró,que se demuestra en esta diapositiva, es que estos dos miARN medidos por QT-PCR son resistentes a la ribonucleasa exógena, a menos que las membranas se suspendieran en presencia de un detergente no iónico, en cuyo caso ambos microARN son degradados. Eso dice, y ese es nuestro criterio para demostrar que el ARN está dentro de la vesícula. Esto se volverá importante. Ahora, a medida que les explico cómo aplicamos ese conocimiento para idear una reacción bioquímica que nos permita comprender el mecanismo de clasificación del ARN. Así que esto es lo que he hecho en mi laboratorio a lo largo de los años, para tratar de comprender los mecanismos moleculares, intentamos idear una reacción bioquímica libre de células que refleje la captura de los miRNAs. Así que aquí está ese ensayo que Matt ideó.

Tomamos células HEK293 y las rompemos mecánicamente colocándolas a través de una aguja de calibre estrecho y obtenemos una preparación con membranas que  sedimentan a baja velocidad. Luego, estas membranas incluyen grandes fragmentos de membrana plasmática, pero también incluyen probablemente membranas endosómicas intactas, como se muestra en esta caricatura. Estas membranas luego se resuspenden y se mezclan con una fracción clarificante de citosol que contiene proteínas citosólicas solubles crudas (no tan purificadas) en presencia de ATP. Y en este caso, una forma madura químicamente sintética de mir223, este material se incuba luego a 30 grados durante 20 minutos con la esperanza de que parte de la mir223 exógena agregada en la incubación pueda internalizarse en las vesículas que se forman a partir de invaginaciones en el interior del endosoma. Una vez completada la incubación, estas membranas se recolectan, se sedimentan y luego se exponen a ribonucleasa exógena para degradar el ARN no incorporado, la ribonucleasa se inactiva y las membranas se disuelven en detergente y la fracción protegida de mir223 se cuantifica mediante Qt-PCR. (PCR cuantitativa)

Entonces, el intento es simplemente detectar la incorporación de mir223 químicamente sintético exógeno en una fracción de vesícula durante el curso de esta incubación. Ahora, esto funcionó y le daré dos ejemplos de los datos que demuestran la eficacia de esta reacción. Si en una incubación completa uno mide la fracción de mir223 que se vuelve resistente a la ribonucleasa exógena pero sensible al detergente  el 9% de este ARN es protegido. Si la incubación se lleva a cabo en paralelo simplemente manteniendo la muestra en hielo en condiciones donde se suprimen los eventos de biogénesis de membrana, la señal es mucho menor, y hay mucho menos protección contra la RNAsa exógena. Ahora, otro experimento que no se muestra aquí, pero que también se publicó, Matt demostró que la presencia de membranas y de citosol al mismo tiempo es esencial para ver la señal (de mir223)

Si omites cualquiera de los dos, no ves la señal. Además, demostró que el ATP hidrolizable estimula esta reacción el doble, pero aún más importante y se muestra a la derecha es el resultado de ese experimento donde Matt programó esta reacción con un microARN puramente citoplásmico en este caso mir190. Este microARN no es secretado por las células y, sin embargo, si lo agrega a la célula para su reacción, puede ver que también está muy mal incorporado durante la incubación de 20 minutos. Muy poco de este se vio protegido contra la ribonucleasa. Así que esta diferencia entre un miRNA de control y mir223 fue bastante reproducible y nos sugirió que estábamos midiendo algo de significado fisiológico, que es un evento de clasificación selectiva de ARN. Ahora, dado que estos ARN están siendo interpretados de alguna manera por una reacción dependiente de citosol suponemos que entre las proteínas necesarias para el sorting habría una o más proteínas de unión a ARN,(RNA binding proteins, RBP) una que definiría la selectividad de la carga en esta reacción.

Y así, lo que Matt y yo diseñamos fue una forma sencilla de encontrar estas proteínas de unión a ARN. Realizó la incubación tal como lo ha visto anteriormente, pero incorporó en lugar de mir223 una forma 3'biotinilada (esto significa que se unio biotina en el extremo 3' del ARN que luego se une con las perlas de streptavidina para una mejor aislación y purificacion) de mir223, que proporciona un gancho que podría usarse para extraer cualquier RBP que se adhiera al ARN durante el curso de la incubación. La incubación se llevó a cabo como antes, una vez completada la reacción, las membranas se trataron con ribonucleasa, la ribonucleasa se inactivó y las membranas se centrifugaron, se disolvieron en detergente y luego  las RBPs que se unieron a mir223 fueron capturadas en perlas de estreptavidina , que luego se sedimentaron y se lavaron, se eluyeron en este caso con sal alta y se realizo una espectrometria de masa, realizado en péptidos disueltos de proteínas que se adhieren a mir223. De las RBP que Matt encontró, una se destacó porque la mitad de su secuencia estaba representada en péptidos en este análisis de espectrometria de masa, y esta proteína ya había sido descrita en la literatura que es secretada por las células en vesículas, se llama YBOX1 o proteína YBX1, es una proteína citoplásmica común en las células de mamíferos y en muchos metazoos. Se ha implicado en otras transacciones de ARN, como en el procesamiento de ARN mensajero, y en este artículo de hace varios años, los autores sugirieron que de alguna manera era un mitógeno extracelular (estimula la division celular), pero de manera importante para nosotros, demostraron que las proteínas YBX1 secretadas por las células son resistentes a la proteasa exógena, a menos que la preparación esté suspendida en detergente, justo lo que se esperaría de las proteínas que se encuentran dentro de la vesícula. Así que usamos un anticuerpo policlonal contra la proteína YBX1 e investigamos su fraccionamiento junto con las vesículas que contenían CD63. También investigamos el empaquetamiento de la proteína YBX1 junto con mir223 durante el curso de la incubación libre de células , esos dos experimentos se muestran aquí.

Centrándose primero en la izquierda, esta fracción unida representa membranas que permanecen asociadas con el anticuerpo CD63. Estas membranas contienen otras proteínas que ya se han descrito en la literatura como asociadas con las vesículas exosómicas o extracelulares y allí, para nuestro consuelo, estaba nuestra proteína YBX1 como se esperaba y CD63. Ahora, centrándonos en la derecha, preguntamos si la proteína YBX acompaña a mir223 en las vesículas en el curso de la reacción. ¿Y si su incorporación depende de las membranas y del citosol? Y esos datos se muestran aquí. En una incubación completa programada con mir223 biotinilada en presencia de membranas y citosol, una vez completada la reacción, tratada con ribonucleasa, las membranas se lavan, se disuelven en detergente y luego se exponen a gotas de estreptavidina, que ayudan a extraer al mir223 biotinilado (esto se llama pull-down, que es extraer una proteina de una mezcla por su afinidad con un soporte sólido, cuando se usan anticuerpos inmovilizados se llama co-inmunoprecipitacion) detectamos  la YBX1, y tenga en cuenta que si la incubación se realiza sin citosol o sin membranas, no se incorporará la proteína YBX1. Además, si la incubación se mantiene en hielo en un control que describí anteriormente, poca o ninguna proteína YBX1 se incorpora a las vesículas y cuando se omite la mir223 biotinilada, entonces, por supuesto, poca proteína YBX1 se detecta empaquetada. Ahora, algo sorprendente acerca de estas observaciones en general fue la ausencia en nuestra preparación o en este experimento de la proteína de unión a ARN que está más estrechamente asociada con la maduración de microRNA, la proteína llamada Argonaute, no vimos Argonaute unida con mir223 en nuestro análisis masivo de espectrometria y esto fue una sorpresa para nosotros y, en particular, para los criticos de nuestro documento.
Ahora, en la literatura, se han hecho afirmaciones de que Argonaute y otras enzimas que procesan microARN, por ejemplo, Dicer (RNAsa que corta los ARN en microARN pequeños) puede estar asociada con el ARN que es empaquetado en vesículas extracelulares. Pero advierto una vez más, estas afirmaciones se han hecho sobre la base de fracciones muy impuras. Cuando se nos hizo esta pregunta de nuestro material, primero en la fracción de pellets (lo que sedimenta) de alta velocidad del medio condicionado y por supuesto, vemos Argonaute en la fraccion de sedimentacion de la centrifugacion a alta velocidad. Si simplemente se lleva este material un paso más allá de purificación, mediante la sedimentación flotante en el gradiente de densidad de sacarosa, se encuentran dos proteínas de membrana constitutivas de vesículas extracelulares, pero Argonaute no se detecta en absoluto. Por lo tanto, creemos que, a diferencia de lo que se afirma en la literatura, las enzimas que procesan microARN, incluida Argonaute, simplemente no se empaquetan dentro de las vesículas extracelulares. Ahora dijimos que YBX1 acompaña a mir223 pero, ¿se requiere para el empaque de mir223? Y para eso hicimos un knock-out CRISPR (se elimina el gen para YBX1).
Hicimos un alelo nulo homocigoto del gen YBX1 en las células HEK293. Debo decir que la proteína YBX1 es esencial para el desarrollo embrionario en el ratón, un nulo homocigoto es letal en el desarrollo embrionario temprano, pero afortunadamente fue posible desalojar o interrumpir ambas copias del gen YBX1 en células cultivadas con HEK293 y estas células eran perfectamente normales y, por lo tanto, nos permitió hacer experimentos para probar el papel de la proteína en el empaque de mir223, de modo que aquí, solo como ejemplo, vemos que la proteína YBX1 no se detecta en estas células que han experimentado una doble mutación de cambio de marco (frameshift mutation, se cambia el marco de lectura). Ahora hicimos dos experimentos. Solo les mostraré uno, pero déjenme resumir el primero. Es posible preparar el citosol a partir de la célula mutante nula YBX1 y preguntar si el citosol ya no es activo o es activo en el sorting de mir223 en vesículas en nuestra reacción libre de células, y Matt encontró que el citosol se redujo cuatro veces en su eficiencia de sorting de mir223 en las vesículas.

También hicimos la misma pregunta sobre las células HEK293 nulas YBX1 viables y los datos se muestran aquí. Si nos fijamos en la fracción del medio (medium fraction) que segregan las células, primero pudimos demostrar que estas células producen la misma cantidad de partículas extracelulares de lo normal, por lo que la proteína YBX1 no es necesaria para la biogénesis de las vesículas extracelulares. Pero si luego examinas el contenido  de miARN en las vesículas secretadas por estas células mutantes, se reduce aproximadamente dos veces en su contenido de mir223 pero se reduce cuatro veces  en su contenido de otro miARN altamente enriquecido, mir144, nos sorprendió el efecto más leve para el mir223, pero resulta que el gen YBX1 tiene dos parálogos: YBX2 y YBX3.

Eso demostró que la ablación de la expresión de YBX2 en la célula nula de YBX1 produce un efecto más pronunciado en el agotamiento de mir223 de las vesículas extracelulares de estas células, por lo que hay una función aparentemente redundante para el YBX1 y sus dos parálogos. No obstante, hay un aumento sustancial en el contenido intracelular (citoplásmico) de estos dos microRNAs en las células nulas YBX1. Así que hay un bloqueo de secreción con un correspondiente aumento  en el citoplasma de los microARNs correspondientes, no habiendo efecto alguno, ni positivo ni negativo en el balance del miARN puramente citoplásmico, mir190. Ahora, posteriormente, en colaboración con Alan Lambowitz, un experto en ARN de la Universidad de Texas. Hemos explorado la gama completa de ARN pequeños en vesículas extracelulares normales y nulas de YBX1, los datos se resumen aquí, publicados más recientemente en el PNAS (Proceedings of the National Academy of Sciences)

La gran mayoría de las pequeñas especies de ARN en nuestras vesículas purificadas son ARNt, mucho más químicamente abundantes que los microARN, pero a esto le siguen dos especies también muy abundantes de ARN Y y ARN de bóveda (vault RNA), que se muestran aquí en la barra verde bastante químicamente abundantes en comparación con los microRNAs. No obstante, de manera interesante para las vesículas extracelulares nulas de YBX1, en todos los casos al menos de estos ARN mayoritarios, existe una reducción sustancial en el contenido de estos ARN en las vesículas extracelulares secretadas por las células nulas de YBX1, los tres ARN están muy agotados. No obstante, hay ARN mensajeros pequeños, pero intactos que no se vieron afectados por la eliminación de YBX1. Todos los resaltados en verde en los símbolos dentro de esta caricatura representan pequeños ARN que se encontraban dentro de las vesículas, como lo demuestra su resistencia a la riblonucleasa, a menos que la incubación se realice en presencia de detergente.

Entonces, todos estos ARN están ahí, pero son ARN resistentes que se degradan si se agrega el detergente. Curiosamente, las vesículas purificadas también tenían ADN, ADN que se predice que codifica para ARN largo no codificante o secuencias que codifican proteínas y, sin embargo, todo el ADN que encontramos asociado con las vesículas purificadas era sensible a la ADNasa exógena incluso en ausencia de detergente. Por lo tanto, creemos que para las preparaciones en las que se ha afirmado que el ADN está en la vesícula, en realidad es ADN que está en el exterior de la vesícula, no dentro de la vesícula. Simplemente esta allí por alguna absorción adventicia durante el procedimiento de purificación y puede no representar una exportación funcional de ADN. El ARN está claramente contenido, SÍ se puede exportar desde las células. Ahora me gustaría referirme durante el resto de la presentación al trabajo de una graduada más reciente.

Hay una maravillosa estudiante graduada peruana en mi laboratorio con el nombre de Morayma Temoche-Díaz. Morayma decidió seguir a Matt examinando las vesículas extracelulares que son producidas por una línea celular de cáncer de mama, llamadas células MB231. Los abreviaré llamándolas células 231 . Esta es una línea de células tumorales invasivas que cultivamos en el laboratorio. Morayma pudo tomar la fracción de sedimento inicial de alta velocidad y mostrar dos poblaciones diferentes con vesículas en el gradiente de densidad de flotación lineal, como se muestra aquí. Encontró, utilizando diferentes proteínas marcadoras, una fracción de baja densidad de flotabilidad, con menos densidad de flotación que las  vesículas que Matt Shurtleff había identificado, y otra especie de vesículas de alta densidad de flotación claramente distinta también, en las que había CD63 muy enriquecida, comparable con la fracción de vesícula que Matt  aisló de las células HEK293.

Así que claramente hay algunos proteínas marcadoras que están presentes en un tipo de vesícula o presentes en el otro y otras que están distribuidas en ambos, aunque separadas  por su densidad de flotación. Ella mostró mediante mass spec analysis (análisis de espectrometría de masas) de estas dos fracciones de membrana separadas, que las especies de densidades de flotación baja  sedimentan junto con las membranas que tienen proteínas marcadoras características de la membrana plasmática y sugerimos sobre esta base que estas vesículas pueden surgir de la yemación de la membrana plasmática, mientras que ella mostró que las vesículas de alta densidad flotante co-sedimentan con membranas que están enriquecidas en proteínas marcadoras endosómicas y, por lo tanto, se sugiere que estas vesículas pueden ser el producto de la secreción de un cuerpo multivesicular. A veces estas vesículas se denominan exosomas. De nuevo, con las fracciones de membrana separadas, Morayma ha podido evaluar su contenido de miARN utilizando una variedad de sondas y resumiré los datos aquí de las vesículas de baja densidad de flotación.

Hubo varios ARN que estaban enriquecidos pero no tan altamente enriquecidos, quizás de 10 a 20 veces enriquecidos, no tan selectivos como los que Shurtleff había identificado y, sin embargo, en las fracciones de alta densidad de flotabilidad que Morayma y Matt habían encontrado antes de un conjunto de miRNAs que son muy altamente enriquecido, algunos más de mil veces, y uno en particular en el que me centraré es en un microARN que generalmente es un microARN específico para el hígado, pero actualmente está siendo secretado por células de cáncer de mama, llamado mir122, por lo que será el foco de ahora. Debido a su alto enriquecimiento y la secreción seleccionada por las células de cáncer de mama, Morayma pensó que podría emplear la reacción bioquímica libre de células de Matt para explorar los requisitos para su empaquetamiento y luego nuevamente notaré que la secuencia de ARN de mir122 es muy diferente de la secuencia de ARN de mir223, sin embargo, utilizando la reacción sin células de Matt como se describe aquí, en este caso, ahora programado con mir122 químicamente sintético. Morayma encontró un paquete bastante robusto de este ARN en vesículas en la incubación sin células, absolutamente dependiente del citosol y, si se omite, la señal se reduce considerablemente, depende en gran medida de las membranas como se ve aquí, y se suprime nuevamente si la incubación completa simplemente se mantiene en hielo.

Morayma decidió preguntar si la proteína que Matt había encontrado, la YBX1 era necesaria para el empaque de mir122 y aquí nos apareció una sorpresa, como se verá en los próximos datos. En primer lugar, Morayma demostró que podía repetir los experimentos de Matt, eso siempre es muy reconfortante cuando alguien más en el laboratorio obtiene los mismos resultados y, por supuesto, ve una buena señal para el empaquetado (packaging) de mir223 absolutamente dependiente de la proteína YBX1 como Matt había demostrado. y sin embargo, cuando se toman las mismas membranas y citosol de las células HEK293 mutantes de YBX1, Morayma encontró un empaquetamiento de mir122 en gran medida independiente de la proteína YBX1, por lo que la señal disminuye ligeramente mientras que el mir223 disminuye significativamente, y también tiene una señal muy baja cuando la incubación se lleva a cabo en hielo.

Así que esto fue muy emocionante, claramente hay requisitos bioquímicos distintos. ¿Qué podría ser eso? Luego, siguiendo nuevamente lo que hizo Matt, Morayma usó la técnica de estreptavidina (proteína que se une a la biotina) empleando un derivado biotinilado (que une la biotina al ARN para un mejor aislamiento y purificación) de mir122, tal como lo había hecho Matt, evaluó la proteína empaquetada en la vesícula junto con el mir122 y encontró un conjunto diferente de proteínas de unión a ARN (RBPs), aparte de las que Matt había encontrado, tres en particular que se muestran aquí, Nucleolina, la proteína Lupus La, en la que me centraré, y otra proteína Nucleofosmina ahora resulta que a diferencia de YBX, al menos en las células de cáncer de mama, cada uno de los genes de estas tres proteínas es esencial, por lo que no fue posible crear un alelo nulo. Bueno, les contaré sobre otros enfoques que Morayma usó para demostrar una dependencia particular para el empaquetamiento de mir122 en esta proteína, el primero fue demostrar que la proteína La está empaquetada en las vesículas extracelulares y esto lo demostró mediante el uso de protección proteolítica de la proteína La en una fracción simple de pellets de alta velocidad. Así que tomó el medio condicionado de las líneas celulares de cáncer de mama, centrifugó las vesículas para formar una fracción de pellets  de alta velocidad sin purificación adicional en este caso, y simplemente expuso el material particulado a la proteinasa K en ausencia o en presencia de TritonX-100 (detergente) y los datos se muestran aquí. Una proteína de membrana característica de las vesículas extracelulares es resistente a la proteinasa K exógena a menos que haya un detergente presente. La proteína La también está claramente presente en la fracción de pellets de alta velocidad, pero resiste a la proteinasa exógena a menos que se agregue detergente, y nuevamente, como ejemplo de la conclusión que saqué antes, la proteína Dicer involucrada en el penúltimo paso en la maduración de miRNA está presente en la fracción de alta velocidad como han demostrado otros y, sin embargo, esta proteína claramente no está protegida por una membrana porque se degrada por la proteinasa exógena en ausencia o la presencia de detergente.

Luego miró, utilizando un anticuerpo policlonal contra la proteína La, para ver si la proteína La está unida a mir122 en una fracción citosólica cruda extraida de células de cáncer de mama MB231 rotas. Con un anticuerpo policlonal anti-La unido a perlas, ella pudo mostrar una inmunoprecipitación específica de la proteína La, aproximadamente el 15% de la proteína La precipita en la fracción cruda, mientras que en el control que contenia perlas no unidas con anticuerpos, no existe precipitación de La. Usando esa señal clara, ella luego evaluó la precipitación de mir122 mediante Qt-PCR de la fracción de inmunoprecipitación y mostró que un nivel comparable, aproximadamente el 15% de ese miRNA puede precipitarse unido a La, mientras que el miRNA de control,  un miRNA verdaderamente citoplásmico, llamado mir182 no está unido a la proteína La, no hay detección en la IP (inmunoprecipitación).

Morayma usó la técnica que fue desarrollada en la UCSF por el grupo de Johnathan Weissman para evaluar la función de La , que consiste en  agotar a La, este grupo diseñó una técnica llamada CRISPRi (interferencia CRISPR), que introduce un promotor regulado adyacente a un gen esencial en este caso, y en el transcurso de un par de días, estas células 231 de cáncer de mama fueron agotandose de La por CRISPRi como se cuantifica aquí, la señal de La se redujo considerablemente durante esos dos días, una reducción de más del 95% en comparación con una proteína citoplásmica de control. Luego evaluó tanto in vitro como in vivo, y les mostraré los dos experimentos. El papel de La en el packaging de mir122. Primero en nuestra reacción libre de células, mostró que el citosol de las células agotadas en La se reduce aproximadamente cuatro veces en su eficiencia de embalaje(packaging) de mir122. Luego, purificó hasta homogeneidad una forma recombinante de La expresada en células de insecto infectadas con el baculovirus para obtener un polipéptido puro. Luego agregó la proteína recombinante pura al citosol, que se había agotado de La mediante la técnica CRISPRi, y pregunta si esa actividad agotada podría ser restaurada por una proteína recombinante exógena.

Y nuevamente, una vez que las proteínas recombinantes vuelven al citosol empobrecido, se restaura la señal del packaging dependiente de La. Ahora nos imaginamos y les demostraré que el citosol contiene muchas otras cosas además de La requerida para la reacción de clasificación o sorting, esto fue fácil de demostrar. Si toma el La recombinante purificado y simplemente lo mezcla con membranas, pero sin citosol adicional, no se puede ver nada, no se logra un empaque de mir122. Así que pensamos que hay muchas otras proteínas que se requieren y ahora es una tarea para los próximos años, tratar de purificar usando la reacción libre de células, todas las otras proteínas que se requieren para este resultado. Pero antes de eso voy a terminar con dos experimentos adicionales. Morayma fue capaz de mostrar que en las células agotadas de La por CRISPRi , las células continuaron produciendo partículas extracelulares en igual abundancia.
Pero esas partículas cuando se aíslan en un gradiente discontinuo (step gradient) de sacarosa se agotan en gran medida de mir122, sin ningún cambio en el miRNA puramente citoplasmático. En consecuencia, hay un aumento en el nivel intracelular de mir122 en estas células, por lo que este se acumula a expensas de la secreción debido a un defecto específico en la proteína La. Finalmente, dado el hecho de que pudimos purificar esta proteína recombinante y obviamente teniamos mir122 químicamente sintético, Morayma ha preguntado muy específicamente cuáles son las secuencias en mir122 que se requieren para que interactúe con una proteína La purificada y esperamos que estas secuencias formen parte de una señal de sorting en el microRNA, requeridz para su empaquetamiento en nuestra reacción libre de células. Primero, demostró mediante el uso de un análisis de cambio de movilidad electroforética (EMSA), que la adición de concentraciones crecientes de la proteína La cambia la movilidad del microARN libre a una especie de movilidad más baja, con una Kd de afinidad muy alta de aproximadamente 5 nanomoles, una afinidad muy fuerte.
Curiosamente, esa afinidad es mayor, es más apretada que la constante de unión (Kd) medida para Argonaute unido a microARN, por lo que una posibilidad interesante es que el mir122 que se empaquetará para secreción puede separarse de la Argonaute  mediante una interacción con la proteína La. Ahora hay una larga historia en la literatura sobre la interacción de La con los ARN mensajeros y se ha demostrado previamente que tres residuos 3' U (UUU) suelen ser el sitio de unión inicial para La en el ARN mensajero. Como se ve aquí, hay tres residuos U cerca del final de mir122, y esta secuencia podría ser la señal de sorting para mir122 y eso fue fácil de probar, Morayma hizo una variante de mir122 sin estos residuos U, y es interesante observar que la variante se empaqueta de manera mucho menos eficiente en nuestra reacción libre de células, con una reducción de aproximadamente cuatro veces su eficiencia de empaque.

Correspondientemente, si uno examina la afinidad de unión entre La y esta variante de mir122, hay una reducción notable en la afinidad de unión de aproximadamente cien veces. Un tremendo defecto en la afinidad, al menos para La. Pero eso no fue suficiente para Morayma. Ella, observó todos los otros miRNAs que están altamente enriquecidos en vesículas de alta densidad flotante (high buoyant density) secretadas por estas líneas celulares de cáncer de mama y observó que aproximadamente la mitad de ellos, comparten una secuencia en una secuencia 5 ', la secuencia es UGGA, que es una secuencia que no se encuentra muy a menudo en el extremo 5 'de miARN puramente citoplásmico, por lo que supuso que la secuencia también era necesaria para la clasificación de mir122 y probó eso obviamente haciendo una variante de esta secuencia y esa variante como la variante del 3 'también es deficiente en el empaquetamiento de miRNA en la vesícula, mientras que el mutante solo se reduce aproximadamente cinco veces en la eficacia de la unión entre la variante sin UGGA y la proteína La (la otra secuencia tuvo una reducción de cien veces)

No obstante, ella ha argumentado y, sobre la base de estos experimentos, hemos llegado a la conclusión de que este miRNA puede tener dos sitios de unión independientes pero cada uno esencial que pueden estar ocupados por dominios distintos en la proteína La. Así que esto es algo que ahora puedes explorar en mayor profundidad utilizando técnicas biofísicas. Pero permítanme resumir lo que he dicho en forma de caricatura que describe los resultados de Morayma y los resultados de Matt.
Pensamos que las células humanas, probablemente todas las células metazoanas que producen estas vesículas tienen una abundancia de diferentes especies de vesículas, algunas de las cuales pueden brotar directamente de la membrana plasmática, estas pueden ser las llamadas vesículas de baja densidad de flotación que Morayma aisló, nosotros argumentamos que estas vesículas tienen una clasificación más pasiva, no tan selectiva de moléculas de ARN que pueden tener un propósito particular, mientras que las vesículas que tienen una alta densidad de flotación tienen un mecanismo de clasificación muy selectivo que involucra una de varias proteínas de unión a ARN diferentes que interactuan individualmente con los miRNA, luego son reconocidos y, de alguna manera, se clasifica (sorting) en una invaginación que yema de la membrana de un endosoma, finalmente se secreta de las células cuando esta estructura se fusiona con la membrana plasmática.
Ahora, un área muy interesante que estamos explorando para esta parte del trabajo es la naturaleza del complejo de ARN y proteínas de unión a ARN que pueden formarse en el citoplasma. Hemos visto en otros experimentos que la proteína YBX1 y el antígeno La se forman punteados (punctate) en el citoplasma, que no está asociado aún con las membranas endosómicas, este punteado podría representar gránulos de ARN o la llamada fase inmiscible líquida-líquida del citoplasma que a menudo se asocia con ARN y proteínas de unión a ARN, creemos que esto podría ser un principio organizador que se requiere inicialmente para identificar aquellas moléculas que van a ser capturadas por invaginación, que finalmente serán secretada por las células.

Y, por supuesto, la pregunta más grande sigue siendo una de las que estamos investigando activamente: ¿qué papel tienen estas vesículas en la entrega de su contenido a las células diana? Esto es algo que presionamos para explorar con las vesículas purificadas y ya no confiamos en el material de partículas crudo, y yo recomendaría a las personas que están interesadas en esta área que realicen al menos un paso adicional en la purificación, para garantizar que sus observaciones sobre el efecto de estas  vesículas tenga un significado en términos de una vesícula. Este trabajo que puse descrito por Morayma se publica en bio-xriv , lo cual hacemos para todos nuestros documentos, ahora los publicamos tan pronto como están listos para su presentación y mi trabajo ha sido visto favorablemente por mis estudiantes y los postdoctorados saben que su mayor aspiración sería publicar un artículo en eLife y no en estas revistas comerciales publicadas por organizaciones piratas como Nelson y Springer.